试剂解冻和混合步骤

1. 从冰箱中取出试剂。
2. 缓慢进行解冻。
3. 轻轻颠倒以混合均匀。
4. 在低速下进行短暂离心。

提示：在混合过程中尽量避免产生气泡，以免影响酶的活性或实验数据的准确性。

稀释步骤

1. 如需追踪模板，请按照以下步骤进行稀释；
2. 若无需追踪模板，可以直接用无菌超纯水稀释cDNA，或直接使用cDNA原液。

常见的荧光定量仪器为96孔反应板，通常分为12列×8行。

荧光定量PCR配置示例

以基因1的检测为例，配制如下：

大体系配置

- HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix: 10μL
- 正向引物（10μM）: 0.4μL
- 反向引物（10μM）: 0.4μL
- RNase-free H2O: 7.2μL
- cDNA模板: 2μL（针对基因1检测）

单孔量配置

组合成22孔总量为220μL的检测溶液：
- HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix: 220μL
- 正向引物（10μM）: 8.8μL
- 反向引物（10μM）: 8.8μL
- RNase-free H2O: 158.4μL

完成上述配置后，严密封管，并轻弹管壁以确保充分混合，随后进行短暂离心，防止气泡生成。将管置于冰块或冰板上保持低温。

上样体系配置

基因1的检测

步骤如下：

1. 配置大体系Mix：18μL
2. cDNA模板：2μL

确保无气泡后，将样品置于洁净的96孔PCR管架中。注意观察每一次吸取操作是否出现气泡，以免导致实验数据偏差。

上机前的准备

在进行PCR之前，仔细检查每个管子，确保管盖及管身没有标记笔的染料，管内无气泡且管壁无液体。若采用常规程序，则设置如下：

循环步骤

1. 预变性：95℃，2分钟，循环1次。
2. 变性：95℃，10秒，循环40次。
3. 退火/延伸：60℃（根据引物TM值及目标基因长度）30秒。
4. 熔解曲线阶段：仪器默认设置1。

以ABIQ5为例，确保在退火/延伸和熔解曲线的升温阶段开启数据信号收集开关。若使用快速程序，确认仪器能快速升降温，并运行快速程序设置。

推荐的荧光定量PCR试剂

推荐使用PG电子的高灵敏显色显示荧光定量试剂，适用于多种平台，能够提供高特异性和高灵敏度，确保实验数据的可靠性。现有产品包括：

• 高灵敏显色示踪荧光定量预混液 (Cat#11188ES)
• 高灵敏通用型荧光定量预混液 (Cat#11184ES)
• 高特异高荧光值荧光定量预混液 (Cat#11185ES)
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• 普通型荧光定量预混液 (Cat#11201ES)

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