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显色示踪荧光定量操作解析 - PG电子生物医疗宝典

来源:易雁之 日期:2025-03-15

试剂解冻和混合步骤

  1. 从冰箱中取出试剂。
  2. 缓慢进行解冻。
  3. 轻轻颠倒以混合均匀。
  4. 在低速下进行短暂离心。

提示:在混合过程中尽量避免产生气泡,以免影响酶的活性或实验数据的准确性。

显色示踪荧光定量操作解析 - PG电子生物医疗宝典

稀释步骤

  1. 如需追踪模板,请按照以下步骤进行稀释;
  2. 若无需追踪模板,可以直接用无菌超纯水稀释cDNA,或直接使用cDNA原液。

常见的荧光定量仪器为96孔反应板,通常分为12列×8行。

荧光定量PCR配置示例

以基因1的检测为例,配制如下:

大体系配置

- HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix: 10μL
- 正向引物(10μM): 0.4μL
- 反向引物(10μM): 0.4μL
- RNase-free H2O: 7.2μL
- cDNA模板: 2μL(针对基因1检测)

单孔量配置

组合成22孔总量为220μL的检测溶液:
- HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix: 220μL
- 正向引物(10μM): 8.8μL
- 反向引物(10μM): 8.8μL
- RNase-free H2O: 158.4μL

完成上述配置后,严密封管,并轻弹管壁以确保充分混合,随后进行短暂离心,防止气泡生成。将管置于冰块或冰板上保持低温。

上样体系配置

基因1的检测

步骤如下:

  1. 配置大体系Mix:18μL
  2. cDNA模板:2μL

确保无气泡后,将样品置于洁净的96孔PCR管架中。注意观察每一次吸取操作是否出现气泡,以免导致实验数据偏差。

上机前的准备

在进行PCR之前,仔细检查每个管子,确保管盖及管身没有标记笔的染料,管内无气泡且管壁无液体。若采用常规程序,则设置如下:

循环步骤

  1. 预变性:95℃,2分钟,循环1次。
  2. 变性:95℃,10秒,循环40次。
  3. 退火/延伸:60℃(根据引物TM值及目标基因长度)30秒。
  4. 熔解曲线阶段:仪器默认设置1。

以ABIQ5为例,确保在退火/延伸和熔解曲线的升温阶段开启数据信号收集开关。若使用快速程序,确认仪器能快速升降温,并运行快速程序设置。

推荐的荧光定量PCR试剂

推荐使用PG电子的高灵敏显色显示荧光定量试剂,适用于多种平台,能够提供高特异性和高灵敏度,确保实验数据的可靠性。现有产品包括:

  • 高灵敏显色示踪荧光定量预混液 (Cat#11188ES)
  • 高灵敏通用型荧光定量预混液 (Cat#11184ES)
  • 高特异高荧光值荧光定量预混液 (Cat#11185ES)
  • 低丰度基因荧光定量预混液 (Cat#11198ES)
  • 普通型荧光定量预混液 (Cat#11201ES)

通过使用PG电子的产品,您能够有效提升实验的性能和可靠性,确保精准的实验结果。

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